摘要:訶子又名訶黎、訶黎勒、隨風(fēng)子,為使君子科植物的果實(shí)。訶子作為中藥在中醫(yī)臨床上廣泛使用,用于油脂抗氧化方面的研究在國(guó)內(nèi)已見(jiàn)有專(zhuān)門(mén)報(bào)道。訶子果實(shí)中含豐富的鞣質(zhì)和多元酚類(lèi),約為30%~40%已有文獻(xiàn)報(bào)道,鞣質(zhì)和多元酚類(lèi)具有較好的抗氧化性。目的建立訶子提取物中鞣花酸含量的高效液相色譜(HPLC)測(cè)定方法。方法色譜條件Shim-packCLC-ODS色譜柱(150mm×6mm,5μm),柱溫30℃,用CH3OH-EtOAc-KH2PO4/H3PO4(0.05mol/L)(體積比30∶2∶68)作為流動(dòng)相,檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm。結(jié)果鞣花酸在0.268~5.36μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。平均加樣回收率為98.42%,RSD為1.13%(n=5)。結(jié)論該方法快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確,可用于訶子中鞣花酸的含量測(cè)定。
【關(guān)鍵詞】訶子;鞣花酸;高效液相色譜
鞣花酸(2,3,7,8-tetrahydroxybenzopyrano[5,4,3-cde]benzopyran-5,10-dione)是一種植物多酚類(lèi)化合物[5](如圖1),為訶子中主要的活性成分之一,廣泛存在于各種自然的軟果、堅(jiān)果等植物果實(shí)中。它對(duì)化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)癌變及其他多種癌變有明顯的抑制作用,它能與人體內(nèi)有害自由基結(jié)合,具有強(qiáng)力祛癌變功效,可以抗衰老、增加機(jī)體免疫,還具有降壓、鎮(zhèn)靜作用,對(duì)多種細(xì)菌、病毒有很好的抑制作用[6]。因此鞣花酸有“克癌之星”“致癌物清除劑”之美稱(chēng)。從機(jī)理上講,鞣花酸是一種抗氧化劑[7],它可作為保健食品添加劑,研究、開(kāi)發(fā)本品具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和廣泛的應(yīng)用范圍。
本實(shí)驗(yàn)建立了HPLC法測(cè)定訶子中鞣花酸含量的方法,并對(duì)文獻(xiàn)報(bào)道的多種色譜條件進(jìn)行了比較[8~10],表明本文方法精確可行。
1儀器與試劑
日本島津SPD-10AT高效液相色譜儀;SPD-10Avp檢測(cè)器;SIL-10AP自動(dòng)進(jìn)樣器;超純水器(arium611UF,Sartorius);超聲波清洗器(AS3120A,天津瑞森特);電子天平(AdventurerTM,AR2140,上海奧豪斯公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(R-200,瑞士Buchi)。島津UV2100型,甲醇為色譜純;實(shí)驗(yàn)用水為超純水,蒸餾水自制,其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?br />
鞣花酸對(duì)照品(購(gòu)自購(gòu)自成都普瑞法科技開(kāi)發(fā)有限公司),純度≥98%。訶子(產(chǎn)自云南臨倉(cāng)和緬甸)。
2方法
2.1色譜條件色譜柱為島津Shim-packCLC-ODS柱(150mm×6mm,5μm),柱溫30℃,用CH3OH-EtOAc-KH2PO4/H3PO4(0.05mol/L)(體積比34∶2∶64)作為流動(dòng)相,檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm。
2.2對(duì)照品溶液的制備精密稱(chēng)取鞣花酸對(duì)照品6.7mg,加甲醇25ml制成每毫升含0.268mg的對(duì)照品溶液。
2.3供試品溶液的制備精密稱(chēng)取訶子粉(均過(guò)60目篩)約1g,置于100ml具塞三角燒瓶中,加60%乙醇25ml,超聲提取60min,過(guò)濾,用60%洗滌濾渣,合并濾液和洗滌液,50℃旋轉(zhuǎn)蒸干,加甲醇定容至10ml,以0.45μm微孔濾膜濾過(guò),濾液作為樣品供試液,進(jìn)樣10μl。
2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制備精密吸取對(duì)照品溶液1.0,2.0,5.0,10.0,15.0,20.0μl進(jìn)樣,測(cè)定峰面積,并以色譜峰峰面積(A)對(duì)對(duì)照品的量(m)回歸(包括原點(diǎn)),得回歸方程為A=7.5777E 06m 9.6700E 05(R=0.9999)。鞣花酸0.268~5.36μg范圍內(nèi),線(xiàn)性關(guān)系良好。
2.5精密度和樣品重復(fù)性實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)對(duì)照品溶液10μl/次,測(cè)得鞣花酸峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=0.9%(n=6);對(duì)同一樣品按擬定的方法作多次測(cè)定,其含量相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=2.1%(n=5)。
a-鞣花酸對(duì)照品b-訶子樣品
2.6回收率實(shí)驗(yàn)采用加樣回收法取已知量的訶子,分別添加一定量的鞣花酸對(duì)照品,按擬定的方法測(cè)定,結(jié)果平均回收率為98.42%,RSD為1.13%(n=5)。
2.7樣品測(cè)定按上述“2.3”項(xiàng)樣品液制備方法測(cè)定云南產(chǎn)訶子和緬甸產(chǎn)訶子中鞣花酸的含量,云南產(chǎn)訶子和緬甸產(chǎn)訶子的鞣花酸含量分別為0.573mg/g(RSD=3.4%)和0.567mg/g(RSD=4.2%)。
3結(jié)果
3.1最佳檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇對(duì)鞣花酸對(duì)照品甲醇溶液的紫外-可見(jiàn)光(200~600nm)掃描發(fā)現(xiàn),鞣花酸在254nm有最大吸收,故選擇254nm為其檢測(cè)波長(zhǎng)。
3.2流動(dòng)相的選擇實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),若僅用甲醇和水作流動(dòng)相,很難實(shí)現(xiàn)多酚物質(zhì)的分離。通過(guò)改變流動(dòng)相的pH值來(lái)提高分離度,由于pH太低會(huì)損壞色譜柱,導(dǎo)致柱效降低。本實(shí)驗(yàn)選用磷酸和磷酸鹽緩沖體系,醋酸乙酯和甲醇作流動(dòng)相,流動(dòng)相中加入了一定量的磷酸,對(duì)鞣花酸起離子抑制作用,使其與雜質(zhì)峰達(dá)到很好地分離。
3.3流速對(duì)分離度的影響在一定流速范圍內(nèi),流速減少,柱效提高,分離度變大。但若流速過(guò)慢,分析時(shí)間延長(zhǎng),縱向擴(kuò)散的影響變大,柱效降低。雖然提高流速可縮短分析時(shí)間,但若流速過(guò)高,物質(zhì)來(lái)不及分離就被洗出,分離效果差,而且會(huì)損壞泵頭和色譜柱。因此,流速對(duì)分離度的影響也很大。最終確定流速為1.0ml·min-1時(shí),出峰時(shí)間和分離效果均較滿(mǎn)意。
4結(jié)論
本法操作簡(jiǎn)單,結(jié)果準(zhǔn)確,重復(fù)性好,可作為該產(chǎn)品的質(zhì)量控制方法。由于訶子提取物具有良好的藥用價(jià)值,對(duì)多個(gè)系統(tǒng)疾病具有良好的治療作用,具有較好的開(kāi)發(fā)前景。本研究采用HPLC法測(cè)定訶子中鞣花酸含量,方法快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確,測(cè)定結(jié)果可靠,為訶子在食品開(kāi)發(fā)及醫(yī)藥應(yīng)用上提供科學(xué)依據(jù)。
(來(lái)源:中國(guó)化工儀器網(wǎng))